2015级生物科学菁英班年终汇报之百问百答


 
  12月27日,2015级生物科学菁英班年终汇报在生科楼534大报告厅顺利举行。为了提升三个年级菁英班学生的旁听效果,鼓励大家主动思考,增强互动交流,报告会设置了“感想疑问”纸,邀请学生们将报告会的所思所感记录下来,会后由班长协助统计整理。我们共收到了来自三个年级菁英班同学的150条提问和53条感想,2015级菁英班同学根据针对自己报告的提问进行了详细的反馈,也督促了15级菁英班学生在报告会后对于自身研究的进一步反思和完善。欢迎各位老师同学批评指正,如有希望针对某位同学的研究或者某个问题进行展开讨论,欢迎发邮件至菁英班辅导员李老师的邮箱,地址为cxli@bio.ecnu.edu.cn。
 
● 杨睿莹:《黑色素生成》,指导教师:叶希韵
Q:为什么参观实验室时用脱毛膏,而这里剃?
A:脱毛膏的作用是使得小鼠毛发生长周期保持一致,使用脱毛膏对于研究毛发生长周期的有关课题意义较大,在这里我们关注的是毛发生长颜色,并且由于施药时间较长,为了放大药物的作用效果,我们要始终保持小鼠背部的无毛状态,剃更为方便,对小鼠皮肤的伤害也较小。
Q:对于能促进黑色素的生成的药物筛选的依据是?是基于前人研究和论文查询吗?
A:药物筛选用于阳性药物的是基于前人的研究,发现新的有生成黑色素生成作用的药物需要我们在细胞水平上进行大量的筛选,然后在小鼠身上进行实验验证
Q:调控黑色素生成的因素那么多,为什么挑酪氨酸酶来研究?
A:因为对于一种物质的生成,具有调节酶活能力的物质的作用效果是最为明显的,并且这也是经验。
Q:注射与外源的作用为什么不同?
A:其实我们对于产生这种差别的原因并没有进行过多的探究,我们主要是要利用这种物质(氢醌)达到构建毛发变白的模型的作用,方式只需要进行初步的探索,选择最有效的方式。有差别的原因有很多,比如我们两种方式的浓度、剂量都不相同,并且体内存在代谢,体外存在药物流失等种种因素。
Q:皮肤黑色素和毛发黑色素是否有差异,若有,在哪些方面有差异?
A:基本上没有差异,只是由于黑素细胞的位置不同。
Q:最终0.6%浓度的选择有没有什么依据?
A:经验,体外实验浓度与细胞实验上药物的浓度扩大有一定的比例
Q:给予药物时,是否作出预实验来测定浓度范围,怎样证明是药物促进过氧化酶表达,而不是解除氢醌影响?
A:有的,但是基本上构建模型参考的文献里有说明,只需要在此基础上微调。后面的问题不是很理解,实验过程中没有出现过氧化氢酶。
Q:为何不在黑色素生成的整个流程每个阶段均进行探索?比较黑色素产生的原因多样
A:我们一般的实验顺序是先寻找能产生表型的药物,再进行原理的探究
Q:人工造成小鼠毛发变白与实际中遗传导致毛发变白有所区别,是否在应用上有所不合适
A:黑素生成的原理应该是相似的,然而体外的药物和遗传上造成变白的机制很可能不同,一种物质的生成是一种很长的过程,任何一个环节受到影响都有可能使得底物的生成异常。
Q:如果药物杀死了细胞导致白发,如何排除?
A:药物的作用我们一般控制在不对小鼠皮肤细胞产生肉眼可见的损害的基础上
Q:请问建模时是否会对小鼠除毛发外其他部分有不良影响?
A:我们没有考虑到这些,现在只是单纯地探究黑色素生成的物质,等到后期的临床应用会考虑这些。
Q:注射和涂抹的作用机制一样吗?
A:药物对细胞的影响作用原理应该是一样的。
Q:在发现作用不明显时,升高药物浓度的依据是什么?
A:不少药物存在低浓度抑制,高浓度促进的情况。
Q:人的毛发和其他哺乳动物有无区别,因此在黑色素的生成有没有差异?
A:按道理说差异不大。
Q:请问是如何筛选药物的?标准是什么?
A:盲筛,然后分析其促进黑色素的情况。
Q:在实验中筛选的药物可不可以使得白发变黑呢?
A:不可以,白色小鼠没有黑色素细胞。
Q:请问在毛发变白后被剃除后涂抹药物生成的毛发是正常的毛发吗?
A:我们关注的重点是毛发的颜色,对毛发的质量没有过多的探究。
 
● 黄荣超、尹智慧:《天然药物对C57BL6小鼠毛发生长的影响及分子机制探讨》,指导教师:叶希韵
Q:为什么取胡须毛囊,与体毛的毛囊有什么区别?可以认为十分相似吗?
A:游离毛囊的体外培养可以控制影响因素,有利于毛囊生长调控机制的研究。用于体外毛囊培养的标本主要有二大类,一是人头皮毛囊,另一是大鼠或小鼠触须部毛囊。小鼠繁殖快,鼠龄容易控制,尤其是小鼠触须毛囊体积较大,解剖显微镜下分离较容易,鼠龄容易控制,实验结果稳定。之所以不取身体部位的毛囊,是因为身体部位的毛囊分布太过密集,分离的难度大。但是如果单从筛药的目的来看,身体部位的毛囊也是可以的。但是考虑到实验操作的简便性,所以选取胡须毛囊。
Q:毛囊长度随天数变化的对照图为什么不左对齐?
A:毛囊随天数变化的图是通过先在显微镜下拍照,集体放大40倍,然后通过PS处理得到的。如下图所示:学弟学妹们指的左对齐应该是图中两条线中透明的那条。我们毛囊长度的初始值是毛囊伸出毛囊体的长度。而在毛囊体内的毛囊长度是不变化的,看起来会有些差异,是因为位于毛囊体内的毛囊底部很难拍清楚,因为被外部包围的组织阻挡了。
Q:有在实验过程中发现促进黑色素合成的药物吗?
A:刚进实验室时,我们本来是想要筛选能促进黑色素生成的药物。当时实验室有师姐在细胞水平上筛的几种药,所以我们就要在动物水平上验证是否也有效。在动物身上用药之前,我们先要建立小鼠毛发脱色的模型。实验思路是这样的:建立了小鼠毛发脱色模型后,用药涂抹小鼠,看和阴性对照相比,药物是否能更快地促进变白小鼠毛发回复黑色。但是在我们建立模型的过程中,发现原本用于建立脱色模型的过氧化氢并没有明显促进毛发的脱色,但是我们却观察到经过氧化氢处理的小鼠比对照组以及另外一个模型组的毛发要生长得快且毛发更多。因此与此同时,我们又展开了对毛发生长的研究。
Q:药物二次筛选中针对毛囊所处生长周期差异性如何筛选并消除这种生长差异性的影响?药物筛选每一轮进行了不同时期小鼠的实验吗?二三次筛选是如何进行的?生长状况及周期查一下是否存在,若存在,对实验有何影响?
A:事实上无法消除,所以只能通过反复三次的筛选来减少由于这样的差异所造成对结果不准确的影响。第2次和第三次筛选是再次用新一批毛囊做实验筛选前一次筛选出来的能促进毛囊生长的药物。
Q:实验中怎样保证离体毛囊与未离体的具有相同反应?为什么选择离体毛囊进行研究?一开始研究室背部生长的速度,后来为何取胡须毛囊?
A:培养毛囊的培养基是Williams′E加L-谷酰胺。通过查文献我们知道,这是小鼠触须毛囊体外培养较适宜的培养基。应用Willams E培养基加2mmol/ L-谷酰胺使毛囊体外培养存活时间明显延长,平均达8天以上,最长者达15天。离体实验的好处是能消除个体其他因素的影响,减少其他无关变量。但是我们在离体实验中筛选出的要最终都要用动物来验证是否真的有效。
Q:静止期,生长期如何判断,如何排除?
A:毛发是周期性生长的,分生长期、退行期和休止期3个阶段。C57BL6小鼠在6~ 8周饲养良好状态下,所有毛囊均由生长期进入静止期,而且生理状态下不再自发进入生长期。经人工脱毛或拔毛等创伤刺激后可诱导其毛发进入生长期,并可自发经过退行期再进入休止期。这个周期活动与自然周期无明显差别。所以到我们准备做动物实验时,可以用脱毛膏处理6-8周的小鼠,使它们同时进入生长期。
Q:若黑色素合成不够,仍涂抹该药物促进毛发生长,促进作用会受到抑制吗?或者长出白色毛发?
A:哈哈,我觉得这个问题非常有趣。黑色素合成和毛发生长的信号通路并不一样,所以不会有抑制,那就是长白发了。
Q:对促进毛发生长的药物如何进行二筛选和再筛选?
A:我们所说的二筛和再筛实际上就是将第一次筛选所得到的阳性药物使用相同的方法进行多次的检验,因为和组织层面的实验不同,动物实验的话耗材巨大,所以我们这样多次重复就是为了尽量保证用于个体实验的药品都是具有阳性作用的。
Q:如何排除之前所提到的由毛囊生长期不同引起的不同?
A:生长周期不同所造成的影响,目前在毛囊的层面上我们都是使用的四个毛囊作为一个空白对照,同时,我们尽量保障同一个药品处理的都是同一只小鼠身上的毛囊,这样的话能够很大程度上避免毛囊层面上的周期不同步的问题。而到了个体层面的时候,我们可以使用确定年龄的小鼠可以实时监控它的毛发生长周期,也可以使用脱毛膏,能够强制的将小鼠背部的毛发生长拖入静止期。
Q:毛囊的生长会不会因为在不同的培养基而有所不同?
A:这是肯定的,组织用的培养基有很多很多(比如什么DMEM之类的)。而在这里我们统一采用的是Williams′E培养基,这种培养基是目前比较公认的能够使毛囊获得做好生长状态的培养基。
Q:有没有对筛出的中药成分进行分析?
A:中药成分的话,如果是分子式的话,每一个中药编号(比如中232)都代表了一个化学物质。至于结构上相似性分析的话,我们还没有做,你这个建议很不错,我觉得对结构的分析可能会对我们之后机制的探讨会有很大的帮助。
Q:中药是否在使用时更加对副作用不可控?
A:关于副作用的话,首先我们拟定的用药方式为外部涂抹,这种用药方式实际上是很保守的。其次我们也提到了,在实验中很多中药成分加进去,毛囊都是不长的,着在我们的实验中也被当作“没有效果或者具有副作用”而被排除在外。如果能够促进毛囊毛发生长的话,应该对细胞不会有毒害作用才对吧?同时我们的药用浓度也控制在一个较低的水准。具体的副作用,可能要等到个体实验结果才能进一步判断。
Q:实验中使用的统计学分析方法是什么?
A:如果说分析软件的话,我们使用的是graphpad(有需要的可以联系我。我这里有,emmmmmm,盗版软件……)如果是统计方法的话,我们将对照组的生长率(处理后的长度/处理前的长度)的平均值记为1,将实验组的生长率按比例与对照组进行换算(如果是对照组的1.2倍,则记为1.2),然后通过使用t-test进行差异性检验,通过看p value来判断差异性。
Q:目前常用的增发剂的原理是什么,和你们实验中的筛选的药物的相同吗?
A:目前使用的米诺地尔机理,研究尚不明确,据说是一个超多因子的组合作用,既然肌理不确定,我们也很难判断和我们的药物是否相似或者不同,因此我们希望使用多种药物的混合使用,如果能有更好的效果那是最好不过的了。
Q:如果毛囊细胞处于静止期,那么假如药物后还会有变化吗?
A:这个需要根据药物的作用机理来思考,因为有一种增加毛发生长的机理就是通过减少毛发的静止期(提前终止)来促进毛发的生长,所以只要能够进行周期的同步,这对筛药是没有太大影响的。
Q:会不会有两种药物共同作用效果较好的情况?         
A:可能有,我们后续会做,请拭目以待。
 
● 董娴:《NioS/NioR对绿脓杆菌致病性相关表型特征的调节》,指导教师:赖玉平、蒋德明
Q:绿脓杆菌耐药机理?
A:通过形成生物膜和产生抗生素灭活酶或修饰酶抵抗药物杀伤,通过主动外排机制限制药物作用
Q:研究鞭毛生长的理由?
A:绿脓杆菌是形成生物膜的常见病原菌,生物膜对细菌的致病性和感染力至关重要。鞭毛是绿脓杆菌粘附相关的重要毒力因子之一,生物膜形成初期依赖鞭毛介导的固相粘附。
Q:绿脓杆菌常感染的伤口?
A:烧伤,烫伤及机械性损伤。绿脓杆菌是烧伤病人皮肤感染的第二大病原菌,也是外科手术伤口感染最常见的病原菌之一。
Q:致病力低与致死率高不矛盾?
A:绿脓杆菌是临床常见的条件致病菌,致病力低,只有当正常机体皮肤屏障功能受损或免疫功能低下时才会引发感染。但绿脓杆菌往往具有多重耐药性,属于超级细菌,据统计,约有三分之二的医院危重病患遭受绿脓杆菌威胁,而且在大多数医疗中心,10%以上的患者死亡是由于绿脓杆菌感染引起的,居革兰氏阴性条件致病菌的首位。
 
● 陈瑜:《RLK-ROP1介导拟南芥雌雄信号传递的功能研究》,指导教师:李晖
Q:这个实验的指导意义是什么?
A:因为“这个”一词指代不清,我也没有办法很明确的回答。那就从我所展示的数据和课题的意义两个方面来讲吧。我所展示的数据是成功构建的质粒的酶切电泳图。为什么要构建质粒?是因为,我们想把我们要研究的基因构建到带有荧光标记GFP的载体质粒上,再把质粒转到农杆菌中,通过农杆菌侵染有YEP标记的ROP的植株中,从而能通过检测两种不同的荧光信号,来看两个蛋白是否有共定位,这是回答两者是否互作的第一步。至于课题本身的指导意义,来自于雌雄互作本身的意义。种子的产生来源于一开始植物的有性生殖,而有性生殖离不开雌雄互作。尤其对于一些我们需要收获种子的作物而言,结种率无疑是非常关键的。而有关雌雄互作机理的研究,不仅仅是关于有性生殖的重要科学问题,也是期望在植物的育性等方面有。
 
● 高文暄:《AUXIN对植物细胞质子泵AHA2的影响》,指导教师:李超 
Q:关于AHA2的运输机制
A: 已有的植物原生质体实验中,用绿色荧光蛋白GFP标记AHA2,我们发现,在野生型(WT)中,AHA2几乎全部定位在质膜上;但是FER突变体中,AHA2定位在胞内(AHA2在内质网上加工,所以猜想在内质网上),由此我们假设,FER激活并协助加工好的AHA2从内质网运输到细胞膜上(一起运输)。
Q:关于AUXIN的作用位点
A:虽然已经知道AUXIN会作用于受体激酶FER,但是现在还无法知道AUXIN是如何与FER作用,是直接还是间接中间是否还有其他调控因子都是还有待研究的问题,不过我们知道的是生长素能通过质子泵Thr947磷酸化导致野生型拟南芥苗细胞外酸化。
 
● 唐慕雪:《中华绒螯蟹B类清道夫受体的功能研究》,指导教师:王群、李伟微
Q:为什么不会抑制细菌的生长?
A:清道夫受体不会抑制细菌的生长,指的是不会直接和细菌接触之后杀死细菌,而是起到了信号传递的作用,将细菌入侵的信号传递给细胞内部下游的分子,由它们来调控吞噬或者抗菌肽的分泌等,杀死细菌。这一个实验的目的是在探索清道夫受体本身免疫调节功能时,排除其直接杀菌作用。                                                                                                                                             
Q:检验的方法是什么?怎么确定基因序列?
A:基因序列是基于转录组的水平上获得的,但并不完整,需要通过设计特异性引物进行PCR,5'/3'PCR等方法,扩增出该基因的全长,切胶回收之后连接到载体上,转入感受态细胞后长出单菌落,挑菌进行菌落PCR,若有目的条带送公司测序,多次重复之后进行clustal比对,获得正确的基因全长。
Q:如何发现这个受体的不同功能的?
A:这个受体的功能是未知的,但是不是完全没有方向,可以从他的结构域推测功能,并结合大量的文献进行预测后设计实验,进行进一步的验证。        
 
● 乐佳怡:《斑马鱼解偶联蛋白基因(UCP)的敲除及其在体功能的初步研究》,指导教师:杜震宇、李东亮 
Q:敲除过程中怎么确认对其它系统没有影响?
A:首先,我们设计的靶位点是ucp1特异性的,意味着正常情况下gRNA与其他基因不会配对或可能性低,不会对其它基因造成改变;其次,实验过程中设置野生型的对照组,可以对比观察到对其它系统的影响;并且,我们可以在获得了ucp1敲除品系后,检测其它家族成员的表达量,查看是否影响相似基因如ucp2\3的表达。
Q:多基因的敲除的斑马鱼有哪些利弊?
A:利处:由于同一个家族的基因相似度高,功能有所重复,所以很可能出现单敲后,其它家族基因表达量升高,导致无法看到表型,多基因敲除避免了这样的情况;其次,由于这些基因在染色体上的位置很靠近,很难通过单敲杂交的方法得到多敲的品系,直接的多基因敲除克服了这个难点;最后,多基因敲除能更好地研究整个家族基因的作用,表型可能更明显、易观察,使得对该家族基因的了解更为方便、全面。
弊端:多基因敲除的靶位点比较难找,甚至可能没有可供多敲的靶位点;如果该家族基因在斑马鱼的生命活动中扮演了非常重要的角色,多基因敲除很可能导致得到的斑马鱼很容易死亡,或者无法得到足够量、可供实验的后代。    
 
● 王伟力:《线粒体能量代谢对罗非鱼抗逆能力的影响》,指导教师:杜震宇 
Q:探究β氧化时,是否考虑用2DG处理以抑制糖酵解,避免糖酵解对β氧化的影响?
A:这是很好的一个想法,其实实验如果是探究β氧化对抗逆性的影响的话,这个处理是必不可少的,但是我们课题的重点是放在了线粒体的能量代谢,所以我们不需要考虑其中到底进行了什么样的一些代谢过程,只需要得到一个线粒体能量代谢受阻的结果就行,而在这个模型的构建中,我们刚好采用的是和脂代谢相关的方法,也得到了线粒体代谢相关基因表达下调,所以已经算是模型构建成功,不需要在做多余的对照。
Q:加入米屈肼造成肉碱下调,脂肪酸消耗量下降,为何体重还下调?而且说到了在鱼类肉中原始条件下已达饱和状态,那么这样做有什么意义呢?
A:对体重下调我们也没有一个合理的解释,只能归咎于当能量代谢受阻后,鱼类抗逆性降低,变得很虚弱,这样的个体原因导致了鱼类体重的下降,或者是,体内脂肪含量过高导致他们食欲降低,反而吸收不到足够的营养。比如在鱼类养殖实验后期我们发现,这些米曲肼处理后的鱼并不喜欢吃饲料,这些也只能是我们的一个猜测,因为没有做后续的实验。其实肉碱达到饱和这个说法,只是我们针对在不同鱼类中,加入肉碱过后效果不同所做出来的一个假说,并不是所有的鱼都达到饱和,而这个实验最主要的目的不在于解释肉碱对于鱼类的重要性,而是在于,利用肉碱作为一个工具,发现了能量代谢对于鱼类免疫的重要性,也可以让人们获得灵感,比如人为的增强线粒体的能量代谢,使得鱼能长的更快更好。
 
● 黄晓昕:《避孕药成分左炔诺孕酮对斑马鱼营养代谢的影响》,指导教师:杜震宇
Q:斑马鱼的性别如何判别?幼鱼时期容易判别么?
A:斑马鱼成年之后可通过其体态判别性别,幼鱼时期主要通过解剖后观察其性腺类型判别性别,有精巢的为雄鱼,有卵巢的为雌鱼。斑马鱼在30天大小左右开始性别分化,早期性腺发育不成熟阶段,较难判别。
Q:研究的目的和对人类社会的意义?
A:主要通过建立模型探究左炔诺孕酮对斑马鱼的系统性影响及可能机制,并由此评估环境水体中存在的左炔诺孕酮对水生动物的可能影响。由于人类排放倒置人工合成的孕激素进入自然环境中,由于研究已得到的左炔诺孕酮的雄激素效应,长此以往可能会影响生态平衡,目前并没有对排放孕激素有明确的限制标准,本实验也旨在限制的制定提供基础。  
 
● 岳丽书:AgNPs exposure impairs development and function of brown/beige adipocytes,指导教师:马欣然、徐凌燕
Q:体内实验如何检测结果?
A:预实验部分,我们给小鼠的左腿腹股沟处注射溶剂作为对照,右腿腹股沟处注射等体积纳米银材料,24h后解剖小鼠取出相应注射部位的脂肪组织,抽提组织RNA,反转成cDNA后通过实时荧光定量PCR实验检测相关产热基因的表达情况,并比较对照组与实验组的差异。
长期实验部分,对12只小鼠进行高脂饲料喂养,平均分为对照组和实验组。每周向对照组小鼠左右腿腹股沟处均注射一次溶剂,向实验组小鼠注射纳米银材料。每周定时检测两组小鼠的体重、体脂并比较两组的变化趋势和差异,从而判断纳米银材料是否会使小鼠变胖。八周后对小鼠进行葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验,并做UCP1的免疫组化染色,从而判断纳米银材料是否会损害小鼠体内的糖代谢过程和米色脂肪的棕色化过程。
Q:白/米色脂肪的区别:
A:白色脂肪(WAT)由大量白色脂肪细胞聚集而成,呈乳白色或淡黄色,细胞中央有一大脂滴,约占细胞体积的 90%,细胞内线粒体含量较少。
Q:棕色脂肪(BAT)是哺乳动物震颤性产热的主要场所,棕色脂肪细胞内的线粒体内膜上   含有大量解偶联蛋白1(UCP1),UCP1通过消除线粒体内膜两侧的质子梯度,使大量用于产生ATP的能量以热能的形式散失。
与单脂滴几乎占满整个细胞的白脂肪细胞不同的是,棕脂肪细胞的脂滴数量多而体积小,细胞内有大量线粒体和高表达的UCP1,且棕脂肪组织相比于白脂肪组织有密度更高的血管分布和神经支配。
当机体处于低温环境时,外界信息经传入神经进入体温调节中枢,兴奋交感神经促进产热,维持体温。最近发现当机体交感神经兴奋时,如运动或处于低温环境,白色脂肪会发生棕色化,转变成一种新型脂肪: 米色脂肪。棕色化过程伴随着UCP1及相关产热基因的高表达,同时细胞中脂滴、线粒体数量明显增多。因此米色脂肪是白色脂肪向棕色脂肪转变的中间体。
在温暖环境下,米色脂肪细胞的形态和功能与白色脂肪细胞更相似;而在寒冷刺激下,其产热能力可大幅提升,UCP1表达量可接近棕色脂肪细胞。  
 
● 赵丹宁:《长期孤雌生殖对水蚤抗性和遗传结构的影响》,指导教师:毛春晓、姜晓东 
Q:怎么确定相关试剂的用量。
A:(1)模仿自然生长条件。
  (2)查阅文献。
  (3)预实验。
Q:如何保证所有个体都孤雌生殖。
A:个体长大后及时清理雄性个体。
 
● 王明浩:GPCR 43 Inactivates Inflammatory Responses in Antibacterial Immunity,指导教师:钱旻
Q:为什么要选12h注菌小鼠腹腔内细胞数?(为什么要在腹腔注射12h后测定)
A:非常好的问题。选定12h(时测定小鼠腹腔液内免疫细胞数)没有文献依据,但有几条原因(促使我这样做)。炎症反应中,中性粒细胞与巨噬细胞的募集存在先后次序:中性粒细胞先募集,巨噬细胞次之。中性粒细胞最快(在菌液注入)1h后便开始募集,4-6h左右其数量达到一个峰值;巨噬细胞约6-8h后开始募集。本实验中为了同时测得中性粒细胞及巨噬细胞,故选定在巨噬细胞募集几小时后(让巨噬细胞积累至一定的数量),即12h时测定细胞数量。但将时间选定为12h也不一定是最合理的。有报道称(Sebastien Tauzin et al.,JBC 2014)在伤口模型炎症反应中,巨噬细胞的聚集会导致中性粒细胞“逆迁移”(从炎症部位迁移出去),故在12h时测得的中性粒细胞数量可能不是峰值。
改进方案:考虑到GPCR43在巨噬细胞、中性粒细胞上的表达量(GPCR43在中性粒细胞、嗜酸性细胞上高表达;在巨噬细胞上表达量一般),直接测定巨噬细胞的数量并不是最优设计。若意图探究GPCR43在该模型炎症反应中的作用,可以将实验改进为“测定腹腔注射4h后腹腔液内中性粒细胞的含量,炎症因子TNF-α、IL-6的含量,趋化因子CXCR2的含量”。
Q:特异性的抗菌作用会不会因为外来物的注射?
A:好问题。即使不考虑细菌的侵入,外来物的注射也会会导致免疫细胞的募集(比如将肉汤注射入小鼠腹腔内会导致腹腔巨噬细胞的募集);腹腔注射对小鼠腹腔膜造成伤害,产生伤口同样会募集巨噬细胞与中性粒细胞;腹腔注射的过程中还可能将外界环境中的细菌、真菌、支原体等微生物一并带入小鼠腹腔中,这些均能引起免疫反应。所以在实验中设定negative control是非常重要的,这可以帮我们排除很多干扰。
由于本实验意图引起急性感染,使用的菌液浓度很高(达到了1x10^7),故菌液引起的免疫细胞募集作用是(导致免疫细胞募集)的主要因素,LB培养基的注射与外界杂菌相比之下可以忽略不计;但腹腔注射产生的伤口引发的干扰(即伤口诱发的免疫细胞募集作用)是比较大的,可能会对已有实验结果产生显著的影响。
  分析归分析,反思归反思,必须重视并反思自己在实验设计上的不足。本次实验展示过程及问答环节使我更加深刻地认识到了negative control在实验中的重要性,在今后的实验设计过程中我要考虑得更加周密,务必保证每个实验都有positive&negative control。希望学习学妹们引以为鉴。
Q:既然已知乙酸对其有影响,为什么不直接用乙酸而用乙酸钠,是担心钠离子有影响么?(引入钠离子会对其造成干扰么)
A:按照正向思维,确实应该注入乙酸而不是乙酸钠;但乙酸挥发性很强,致使实验很难定量,且浓度过高的乙酸对小鼠有刺激作用。使用乙酸钠代替乙酸进行试验有利有弊:好处是容易定量、实验重复性强;坏处是引入了钠离子、可能对实验有干扰。
目前想到的解决方案(可能并不完备):测定乙酸钠的pH值,根据pH值配制NaCl与NaOH的混合溶液,将其同菌液一并注射入小鼠腹腔内,以此作为该实验的negative control。
Q:应用前景(GPCR43的应用前景?)
A: ①GPCR43和脂代谢及肠道功能:GPCR43及其配体在脂肪合成中具有重要的作用,GPCR43的激活可以直接抑制脂肪的降解。有报道称GPCR43缺失的小鼠在正常饮食条件下会发胖,而对于GPCR43过表达的小鼠即使喂食高脂肪的食物也不会发生肥胖(KIMURA I et al., NAT COMMUN 2013)。GPCR43或许可以作为一个靶点来调节脂代谢。GPCR43与肠道微生物之间有很多关联有待探明,这与人体脂代谢密切相关;小鼠肠道的实验已经表明肠道微生物菌群可以通过影响短链脂肪酸受体的表达和肠肽的分泌来调节脂肪的代谢,但因人的肠道微生物(与小鼠)差异很大,其机制尚需进一步研究。
  ②GPCR43和炎症:在急性和慢性肠炎、关节炎和哮喘病例中,GPCR43 knock out小鼠无法消除炎症,甚至还会不断加重(Kendle M. Maslowski et al. , Nature ,2009),这揭示了GPCR43在慢性炎症中的抑炎作用。以GPCR43作为靶点可以提供一种治疗慢性炎症疾病的新思路。
③GPCR43和癌症:已有研究表明肠道菌群对结肠癌的发生和发展过程有影响(ROWLAND I R. et al., CURR PHARM DESIGN 2009),但其在结肠癌中发挥的功能有待进一步确定。GPCR43有成为治疗结肠癌的一个靶点的潜力。
Q:如何模拟体内急性感染的状态(如何与为何建立急性感染模型)
A:本实验所使用的菌液浓度为“使小鼠的存活时间为12h-24h”,若小鼠不死于抽取腹腔液,它们的存活时间也不会超过24h,可以说是很急性的感染了。
  设立“急性感染模型”源于师兄的经验:24h与72h为小鼠细菌感染的生存节点。在设计实验时我为了追求“急性感染”的效果(这样能使得测得的细胞数目较多,且更容易体现出统计性差异、突出GPCR43的功能),便对菌液的浓度做出了这样的设定。
  但这样的实验设计是否合理有待商榷:首先小鼠之前存在很大的个体差异,预实验得到的菌液浓度并不能保证所有的小鼠的生存时间均在这个范围内(即有许多小鼠能活超过24h导致模型设定失败);且太高的菌液浓度容易导致一些体弱的小鼠死亡,减少了实验样本数、增大了实验数据的随机性。
Q:GPCR43信号通路是?筛选及检测的方法有哪些?
A:这两个问题表述太过于简洁且语义不够准确,以至于我无法理解提问者的提问意图。我对这两个问题恕不作答,希望学弟学妹们能体谅海涵。若学弟学妹们对我的展示&实验仍有疑问,或对我给出的问题解答不满意&有追问需求,欢迎通过社交媒体与我联系。
 
● 王熙:《联合PD-1增强NKG2D-CAR-T抗肿瘤效应》,指导教师:江文正
Q:构建载体过程?
A:设计两端为BamHI的引物 PCR扩增目的序列 单酶切载体 胶回收载体和目的序列片段 连接酶连接载体和目的序列 将重组质粒转入感受态细胞 抗生素筛选 基因测序鉴定新构建的CART细胞表面也有PD-1受体,细胞核里的基因是合成固定于细胞膜上的PD-1 导入的质粒合成分泌型的。
 
● 王钰清:《对胍基苯甲酸修饰的低分子量聚合物的合成及其递送生物大分子性能的相关研究》,指导教师:程义云
Q:改变蛋白质空间构型的操作方法?
A:我可以理解成蛋白质变性的方法吗?变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响,改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏,都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等;能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。
Q:转蛋白的应用?
A:不知道你想问的是不是蛋白治疗的应用呢?蛋白质治疗( Protein therapy )主要通过两种方式达实现疾病治疗,一种是在体外可以操控信号通路,并诱导多功能干细胞的组织分化或激活机体潜在的抗肿瘤免疫细胞以及促进伤口的愈合;另一种方式则是在体内,目的蛋白可以有效替代功能失调或低表达或者丢失的蛋白质。蛋白质治疗给例如炎症,癌症,脑损伤,糖尿病等疾病提供了有效的治疗方案。到目前为止,已有大约100多种不同功能的蛋白质被成功递送进入多种哺乳动物的细胞中,并已成为临床研究试验的主要依据之一。两篇参考文献,有兴趣可以看一下~[1] Kratz F, Elsadek B. Clinical impact of serum proteins on drug delivery [J]. J Control Release: official journal of the Controlled Release Society. 2012; 161: 429- 445. [2] Vasconcelos L, Parn K, Langel U. Therapeutic potential of cell-penetrating peptides [J]. Ther Deliv. 2013; 4: 573- 591.
Q:蛋白治疗的优点(相对基因治疗)
A:相对于基因治疗,蛋白治疗直接将蛋白转入细胞内发挥功能,不存在基因转录再翻译的过程,基因导入细胞后还存在一个是否插入基因组和插入位置是否正确的问题,这都决定了基因治疗的效果,而且有的目的基因例如siRNA自身稳定性差且容易被降解。
Q:蛋白转染效果好坏的指标
A:本课题转蛋白用的是绿色荧光蛋白。首先可以在荧光显微镜下观察,若观察存在细胞形态,则将细胞消化,收集起来,用流式细胞术检测细胞内的绿色荧光强度,最后可以通过激光共聚焦显微镜共定位细胞与蛋白,以此来判断蛋白转染效果的好坏。
Q:核酸带负电的影响
A:由于细胞膜是负电荷性的,因此同样带负电的核酸便不能很好的与膜结合,自身很难进入细胞,必须依靠外界载体的辅助。
Q:化学载体如何进入细胞
载体与目的生物大分子结合所形成的载体复合物进入细胞主要通过三种形式分别为:物理法、化学法和生物法。物理法主要通过显微注射或者电穿孔等方式直接穿透细胞膜并将目的基因递送至靶细胞中,其靶向性强且无免疫原性,但由于其只能作用单个或多个细胞,因而转染效率较低,同时具有一定机械损伤;生物法则主要借助病毒来实现对基因的递送,通过将目的基因导入病毒基因的非特异性位点,并通过病毒感染细胞的方式将目的基因导入靶细胞内,常用病毒载体主要来源于腺病毒、逆转录病毒、痘病毒等,其靶向性相对较强同时转染效率也较高,目前基因治疗中的80%均采用病毒作为载体提升转染效率,但由于其具有一定的免疫原性、同时对目的基因大小有一定的限制,因而阻碍基因治疗的进一步发展。而化学法则是主要利用脂肪酸自组装形成脂质体并将核酸或蛋白质包裹于其中; DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀等与核酸形成几十至几百纳米的转染复合物方法通过改变生物分子-载体复合物与细胞表面的吸附能力或者通过改变细胞膜通透性进而实现提升靶细胞对复合物的摄入,但转染效率较低且细胞毒性巨大。 
基因递送过程主要是通过DNA质粒或siRNA与载体所形成稳定复合物,凭借细胞膜表面的载体蛋白帮助复合物进入细胞的内含体,并利用载体的“质子海绵”效应帮助内含体膜破裂,从而使得复合物进入细胞质,胞内蛋白竞争性结合载体导致复合物解离,siRNA直接在细胞质起作用,DNA则进入细胞核进行表达,两篇参考文献,有兴趣可以找来看看~~[1] Thomas M, Klibanov AM. Non-viral gene therapy: polycation-mediated DNA delivery [J]. Appl Microbiol Biotechnol. 2003: 62: 27- 34.[2] Whitehead KA, Langer R, Anderson DG. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery [J]. Nat Rev Drug Discov. 2009; 8: 129- 138.
蛋白质递送过程大致分为两个过程。第一步蛋白质进入细胞,主要通过两种方式,一种是在不改变蛋白质功能活性的基础上,在目的蛋白表面修饰一些能够被细胞识别的小分子,帮助目的蛋白进入细胞;另一种是转染载体与目的蛋白质之间形成稳定的共价复合物,并通过膜融合或细胞的内吞作用的方式进入细胞;第二步蛋白质从内含体释放进入细胞质。几篇文献,有兴趣可以看看~~[1] Rodrigues M, de la Torre BG, Radis-Baptista G, Santos NC, Andreu D. Efficient cellular delivery of beta-galactosidase mediated by NrTPs, a new family of cell-penetrating peptides [J]. Bioconjug Chem. 2011; 22: 2339- 2344.[2] Bersani S, Salmaso S, Mastrotto F, Ravazzolo E, Semenzato A, Caliceti P.  Star-like oligo-arginyl-maltotriosyl derivatives as novel cell- penetrating enhancers for the intracellular delivery of colloidal therapeutic systems [J]. Bioconjug Chem. 2012; 23: 1415- 1425.[3] Dang JM, Leong KW. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2006; 58: 487- 499。
 
● 何潇:《骨靶向纳米材料通过光热联合治疗骨肿瘤的研究》,指导教师:程义云
Q:如果应用于临床,需要面对什么问题吗?
A:应用于临床所需要的问题和很多其他药物一样:是否有效、持续时间如何、对人体是否有毒害作用等等,最主要的是与现有的疗法相比有没有非常突出的优点达到足够取代的程度。
Q:纳米材料的选取有什么要求?
A:生物相容性好、能够形成纳米尺度的物质、容易进行表面修饰或者携带药物。
Q:MTT指的是什么?
A:MTT是噻唑蓝这种染料的简写,用MTT做细胞毒性实验建成MTT实验。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢,用酶标仪在490nm波长处(英文说明书写的是570nm)测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。
Q:载药率仅8%左右,为什么是可以接受的?
A:因为这个载药效率下足以发挥药物的效能了。
Q:该纳米材料抑制肿瘤细胞的原因?
A:通过光热起到杀肿瘤的作用,同时也通过磷酸氯喹降低骨肿瘤所造成的破坏骨结构的副作用。
Q:骨肿癌是骨块腐蚀吗?
A:不是的,骨肿瘤就是发生于骨骼或其附属组织(血管、神经、骨髓等)的肿瘤,骨块腐蚀是它的副作用之一。
Q:HPLC具体在这个实验中是如何应用的?
A:溶液中磷酸氯喹的浓度可以通过HPLC结果的峰面积来判断,所以只需要先做一组CQ标准浓度的溶液做HPLC,根据峰面积的结果画出标准曲线,就可以根据样品HPLC结果中的峰面积判断样品溶液中CQ的浓度了。再通过离心上清液中的CQ浓度与使用的总的CQ浓度对比就可以反映结合到PDA上CQ的量,继而算出载药的效率。
Q:红外升温会不会对正常骨组织产生影响?
A:应该是有的,但是远小于对癌细胞产生的影响。
 
● 凌靖:《表面富含羟基的低代数形高分子作为高效低毒的基因转染载体》,指导教师:程义云
Q:为什么松散的结构易于过膜?
A:松散的结构不易于过膜,一般带有含氟或者苯环结构的材料易于过膜。因为细胞膜由磷脂双分子层构成,是具有动态较软的结构,含氟或者苯环结构的材料具有刚性,所以易于穿膜(通过形成囊泡结构)。而碳链之类的材料,结构较为松散,具有柔性,易于与细胞膜结合而不易出膜,从而卡在了细胞膜上。
Q:为什么随着PAMAM代数的增加细胞毒性也会增加?
A:随着PAMAM代数的增加,表面NH2增多,所带正电荷增多。而树枝状大分子表面高密度的正电荷可能是其产生细胞毒性的主要因素之一。例如, 表面为正电荷的PAMAM 对B16F10 鼠黑素瘤细胞株有显著的毒性, 但是表面为负电荷的PAMAM 却未显示细胞毒性。并且Fuchs等通过对人MCF-7乳腺癌细胞株的体外细胞毒性实验提出, 树枝状大分子本身的3D空间结构对细胞毒性的产生无明显作用, 表面基团是毒性产生的关键因素。